Gi-edit ni Peter Sarnow, Stanford University School of Medicine, Stanford University, California, gi-aprobahan kaniadtong Disyembre 25, 2020 (gisusi kaniadtong Oktubre 25, 2020)
Gi-report namon ang interaksyon tali sa mga subunit sa pagkopya sa mga komplikado nga transkripsyon sa coronavirus, nga hinungdanon alang sa pagkopya ug pagpreserbar sa ebolusyon.Naghatag kami og ebidensya nga ang NiRAN domain nga nalangkit sa nsp12 adunay nucleoside monophosphate (NMP) transferase nga kalihokan sa trans, ug giila ang nsp9 (usa ka RNA binding protein) isip target niini.Ang NiRAN nag-catalyze sa covalent attachment sa NMP nga bahin sa gitipigan nga nsp9 amino terminal sa usa ka reaksyon nga nagsalig sa Mn2+ ion ug kasikbit nga gitipigan nga Asn residues.Nakaplagan nga ang kalihokan sa NiRAN ug nsp9 NMPylation hinungdanon alang sa pagkopya sa coronavirus.Gitugotan kami sa datos nga i-link kini nga kalihokan sa nested virus enzyme marker sa miaging mga obserbasyon sa hypothesis nga ang pagsugod sa RNA synthesis sa usa ka klase sa mga virus sa RNA mao ang functionally ug evolutionaryly consistent.
Ang RNA-dependent nga RNA polymerase (RdRps) sa Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, ug 12 pa ka pamilya) nalambigit sa amino-terminal (N-terminal) domain sa non-structural protein (nsp) nga gipagawas gikan sa polyprotein, nga gitawag ug NiRAN Ang 1ab gilangkuban sa viral main protease (Mpro).Kaniadto, ang arterial virus NiRAN-RdRp nsp's kaugalingong GMPylation/UMPylation nga kalihokan gitaho, ug kini gisugyot nga makamugna og usa ka lumalabay alang sa pagbalhin sa nucleoside monophosphate (NMP) ngadto sa (karon wala mailhi) nga virus ug/o cell biopolymerization Things.Dinhi, among gipakita nga ang coronavirus (Human Coronavirus [HCoV]-229E ug Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) adunay Mn2+-dependent nga NMPylation nga kalihokan, nga nakuha gikan sa nsp9 pinaagi sa pagporma sa Mpro-mediated nsp9 Human. ang N-terminal flanking nsps kay proteolytically gipagawas, ang phosphoramidate gigapos sa nag-unang amine (N3825) sa N-terminal sa nsp9.Ang uridine triphosphate mao ang gipalabi nga nucleotide niini nga reaksyon, apan ang adenosine triphosphate, guanosine triphosphate, ug cytidine triphosphate angay usab nga mga co-substrate.Ang mga pagtuon sa mutation gamit ang recombinant nga coronavirus nsp9 ug nsp12 nga mga protina ug genetically engineered nga HCoV-229E mutant nagtino sa mga residues nga gikinahanglan alang sa NiRAN-mediated nsp9 NMPylation ug virus replication sa cell culture.Gikumpirma sa datos ang panagna sa mga residu sa aktibo nga site sa NiRAN ug gitino ang hinungdanon nga papel sa mga residu sa nsp9 N3826 sa nsp9 NMPylation ug replikasyon sa virus sa vitro.Kini nga residue kabahin sa gitipigan nga N-terminal NNE tripeptide sequence ug napamatud-an nga mao lamang ang invariant residue sa nsp9 ug ang mga homolog niini sa pamilyang coronavirus.Kini nga pagtuon naghatag ug lig-on nga pundasyon alang sa functional nga pagtuon sa NMPylation nga kalihokan sa ubang mga nested virus ug nagsugyot ug posible nga mga target alang sa pagpalambo sa antiviral nga mga tambal.
Ang Nidovirales nga positibo nga na-stranded nga RNA nga virus nakaapekto sa lainlaing mga vertebrates ug invertebrates (1, 2).Ang order karon naglakip sa 14 ka pamilya (3), diin ang pamilyang Coronavirus kay kaylap nga gitun-an sa miaging 20 ka tuig.Nianang panahona, tulo ka zoonotic coronavirus ang migawas gikan sa mga host sa hayop ug hinungdan sa daghang mga pagbuto sa grabe nga impeksyon sa respiratoryo sa mga tawo.Naglakip sa padayon nga mga pandemya nga gipahinabo sa grabe nga makatakod nga mga sakit.Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Ang mga Nidovirus adunay komon nga genome nga organisasyon, ug ang subunit sa membrane-bound replication-transcription complex (RTC) gi-encode sa 5-?²-terminal nga dos-tersiya ug ang nag-unang structural subunit sa partikulo sa virus, ingon man pipila ka mga accessories. .Protina, gi-encode sa 3??² katapusan sa ikatulo nga bahin sa genome (1).Gawas sa usa ka pamilya sa mga planarian virus (Monoviridae) (8), ang tanang nested virus nag-encode sa RTC subunits sa duha ka dagkong open reading frames (ORF) ORF1a ug ORF1b, nga gihubad gikan sa genomic RNA sa.Ang ORF1a nag-encode sa polyprotein (pp) 1a, ug ang ORF1a ug ORF1b dungan nga nag-encode sa pp1ab.Uban sa kinatibuk-ang partisipasyon sa nag-unang protease (Mpro) nga gi-encode sa ORF1a, ang pp1a ug pp1ab giproseso nga proteolytically ngadto sa lain-laing mga non-structural proteins (nsps), nailhan usab nga 3CLpro, tungod kay kini adunay homology sa 3Cpro sa picornavirus ( 9).Kini nga mga nsps gituohan nga gitigum ngadto sa usa ka dako nga dinamikong RTC, nag-catalyze sa synthesis sa genomic RNA (replication) ug usa ka set sa subgenomic RNA (transcription), ug gigamit sa pag-coordinate sa ekspresyon sa ORF nga nahimutang sa ubos sa ORF1b (10? ? ?12).
Ang kinauyokan nga RTC naglakip sa RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) (13), superfamily 1 helicase (HEL1) (14, 15) ug ubay-ubay nga RNA processing enzymes, nga nag-una nga naka-encode sa ORF1b ug sa coronavirus family Naglangkob kini sa nsp12-nsp16 ug An nsp9-nsp12 in nahilalakip ha familia nga Arterioviridae (tan-awa ang reperensiya 10ââ 12).Ang RdRp ug HEL1 nagrepresentar sa duha (usa-ikalima) nga gikonserbar nga mga dominyo sa virus sa salag sa langgam ug adunay homology taliwala sa ubang mga virus sa RNA.Ang core replicase gituohan nga gitabangan sa ubang mga subunit, lakip ang daghang gagmay nga nsps nga gipagawas gikan sa carboxy-terminal (C-terminal) nga rehiyon sa pp1a, sa ubos sa Mpro (coronavirus nsp5 ug arterial virus nsp4, matag usa).Sila adunay limitado nga panalipod sa pamilya ug lain-laing mga kalihokan (gisusi sa reperensiya 10ââ12).
Bag-ohay lang, usa ka domain nga adunay talagsaon nga sequence motif nga mga kinaiya ang nakit-an sa amino terminal (N-terminus) nga kasikbit sa RdRp sa tanan nga nested virus, apan wala’y ubang mga RNA virus (16).Base sa iyang lokasyon ug nucleotide transferase (nucleoside monophosphate [NMP] transferase) nga kalihokan, kini nga domain ginganlan og NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase).Ang dual-domain nga kombinasyon sa NiRAN-RdRp naglangkob sa nsp12 sa Coronaviridae nga pamilya ug nsp9 sa Arterioviridae nga pamilya, ug sa ubang mga nestoviridae, ang NiRAN-RdRp gilauman nga ipagawas isip independente nga nsp gikan sa viral polyprotein.Sa coronavirus, ang NiRAN domain adunay ??1/450 residues ug konektado sa C-terminal RdRp domain pinaagi sa linker region (16?19).Sa Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae), ang recombinant nsp9 nagpakita sa Mn2+ ion-dependent (kaugalingon) UMPylation ug GMPylation nga mga kalihokan, nga nagdepende sa tulo ka gitipigan nga mga base sa han-ay sa nestovirus, AN, BN ug CN Ang mga nahabilin sa han-ay.Diin ang N nagpasabot sa NiRAN) (16).Ang N-terminal flanking niini nga mga motif kay dili kaayo konserbatibo nga motif preAN.Ang pipila niini nga mga residue gitipigan usab sa layo nga may kalabutan nga protina kinases, diin kini gipakita nga nalambigit sa nucleoside triphosphate (NTP) nga nagbugkos ug catalytic nga kalihokan (20, 21).Nahiuyon sa kini nga obserbasyon, daghang mga yawe nga nahabilin nga aktibo nga site sa pseudokinase SelO gikan sa Pseudomonas syringae mahimong matipon sa bag-o lang gipatik nga SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 supercomplex.Gitipigan ang Coronavirus NiRAN residues nga gipatong sa electron microstructure.Recombinant nga protina (17).Gituohan nga ang dokumentado (kaugalingon) U / GMPylation maghimo usa ka lumalabay nga estado aron ibalhin ang NMP sa (karon wala mahibal-an) nga substrate (16), ug ang pagkaparehas sa istruktura tali sa NiRAN ug protina kinase (17, 19) ) Mao ang hypothesis nga Ang NiRAN nagbag-o sa ubang mga protina.
Daghang mga bahin, lakip ang talagsaon ug talagsaon nga sistematikong asosasyon sa mga nested virus ug genetic separation gikan sa RdRp, naghimo sa NiRAN nga usa ka makatarunganon nga key regulatory enzyme alang sa mga nested virus, nga kritikal sa ilang pagtungha ug pagkatawo.Kaniadto, tulo ka posible nga mga gimbuhaton nga naglambigit sa NiRAN aron makontrol ang genome / subgenomic nga paghubad o replikasyon / transkripsyon ang gitawag.Kung gikonsiderar ang nihit ug dili kompleto nga datos nga magamit sa panahon, ang matag function adunay mga bentaha ug disbentaha (16).Sa kini nga panukiduki, gitumong namon nga isagol ang biochemical ug reverse genetic nga mga pagtuon sa mga coronavirus nga nagrepresentar sa duha nga mga genera, ug ibutang ang among mga nahibal-an sa ebolusyonaryong background sa natural nga mutation sa pamilyang coronavirus, aron makakuha og panabut sa kini nga Misteryoso nga gingharian.Gi-report namon ang dagkong mga pag-uswag sa pagsabut sa NiRAN pinaagi sa pag-ila sa mga natural nga target sa RTC, nga (taliwala sa tulo nga magamit nga hypotheses) nakatampo sa papel niini nga domain sa pagsugod sa synthesis sa nested virus RNA.Kini nga panukiduki nagbukas usab sa mga posibilidad alang sa ubang mga tahas sa NiRAN sa interface sa host sa virus.
Aron mailhan ang mga enzymatic nga kabtangan sa corona virus nga nsp12 nga may kalabotan sa NiRAN domain, naghimo kami usa ka recombinant nga porma sa human coronavirus 229E (HCoV-229E) nsp12 sa E. coli, nga adunay tag His6 sa C-terminus, ug gihiusa ang protina nga adunay [α32-P ] Paglumlum uban sa NTP sa presensya sa MnCl2 sama sa gihulagway sa Mga Materyal ug Pamaagi.Ang pag-analisa sa produkto sa reaksyon nagpakita sa presensya sa usa ka radiolabeled nga protina nga co-migrating uban ang nsp12 (106 kDa), nga nagpakita nga ang coronavirus nsp12 nag-catalyze sa pagporma sa covalent protein-NMP adducts, mas gusto nga naporma sa uridine monophosphate (UMP) (Figure 1A) Ug B).Gipakita sa quantitative analysis nga kon itandi sa ubang mga nucleotides, ang signal intensity sa UMP incorporation misaka sa 2 ngadto sa 3 ka beses (Figure 1C).Kini nga datos nahiuyon sa gitagna nga NMP transferase nga kalihokan sa NiRAN domain sa coronavirus (16), apan nagpakita nga ang mga gusto sa nucleotide sa NiRAN domain sa coronavirus ug ang arterial virus lahi.
Kalihokan sa kaugalingon nga NMPylation sa HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) gilumlom sa gitudlo nga [α-32P] NTP sa presensya sa 6 mM MnCl2 sulod sa 30 minuto (tan-awa ang Mga Materyal ug Pamaagi alang sa mga detalye).Ang mga produkto sa reaksyon gibulag sa SDS-PAGE ug gibulingan sa Coomassie brilliant blue.(B) Ang radiolabeled nga protina makita pinaagi sa phosphorous imaging.Ang mga posisyon sa nsp12-His6 ug protina molecular mass marker (sa kilodaltons) gipakita sa A ug B. (C) Ang intensity sa radioactive signal (mean ± SEM) gitino gikan sa tulo ka independenteng mga eksperimento.*P≤0.05.Ang kusog sa signal (porsiyento) nalangkit sa UTP.
Bisan kung ang mga kalihokan sa enzyme nga may kalabotan sa NiRAN gipakita nga hinungdanon alang sa pagkopya sa EAV ug SARS-CoV sa kultura sa cell (16), ang piho nga function sa NiRAN ug potensyal nga mga target wala pa matino.Ang bag-o nga gitaho nga pagkaparehas sa istruktura tali sa NiRAN ug usa ka pamilya sa mga protina nga adunay mga folds nga sama sa protina kinase (17, 22) nag-aghat kanamo sa pagsulay sa pangagpas nga ang NiRAN nag-catalyze sa NMPylation sa ubang mga protina.Naghimo kami usa ka hugpong sa mga potensyal nga homologous nga target, lakip ang mga non-structural protein nga gi-encode sa HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), ang matag usa adunay C-terminal His6 tag (SI appendix, Table S1), Ug incubate kini nga mga protina sa [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) sa presensya o pagkawala sa nsp12.Bovine serum albumin ug MBP-LacZα fusion protein nga gihimo sa E. coli nagsilbing mga kontrol (Figure 2A, lane 1 hangtod 7).Ang radiolabeled nga protina gisusi pinaagi sa sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) ug autoradiography, ug nakit-an nga adunay kusog nga radioactive signal sa reaksyon nga adunay nsp12 ug nsp9.Ang posisyon sa signal katumbas sa molekular nga masa sa nsp9, nga nagpakita sa nsp12-mediated UMPylation sa nsp9 (Figure 2B, track 7).Wala’y ubang mga protina sa pagsulay nga nakit-an nga UMPylated, nga nagdala kanamo sa paghinapos nga ang nsp9 usa ka piho nga substrate sa nsp12.Nahiuyon sa datos sa kaugalingon nga NMPylation nga gipakita sa Figure 1, ang nsp12 makahimo sa pagbalhin sa tanan nga upat ka NMPs sa nsp9, bisan kung lahi ang kahusayan, UMP> adenosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP) ) ( Hulagway).3 A ug B).Ubos sa mga kondisyon nga gigamit niini nga assay (pamubo ang reaksyon ug oras sa pagkaladlad, pagpakunhod sa konsentrasyon sa nsp12; mga materyales ug pamaagi), ang self-NMPylation sa nsp12 dili mamatikdan (itandi ang Figure 2B, lane 7, ug Figure 1B), nga napamatud-an nga epektibo (Ug daghang mga hugna) Ang UMP mibalhin gikan sa nsp12 hangtod sa nsp9.Ang kalihokan sa pagbalhin sa UMP nanginahanglan sa presensya sa mga Mn2 + ion, ingon sa gipakita sa Figure 3C, samtang gamay ra nga kalihokan sa pagbalhin sa UMP ang naobserbahan sa presensya sa Mg2 +, ug wala’y kalihokan sa presensya sa lain nga duha ka divalent cations nga gisulayan.Ang susamang datos nakuha sa NMPylation assays nga adunay cytidine triphosphate (CTP), guanosine triphosphate (GTP), ug adenosine triphosphate (ATP) (SI appendix, Figure S1).
HCoV-229E nsp12-mediated UMPylation sa nsp9.Usa ka serye sa mga substrate sa protina (lakip ang bovine serum albumin, MBP-lacZα, ug usa ka serye sa HCoV-229E nsps nga gimarkahan sa C-terminal His6 nga gi-encode sa ORF1a) gigamit sa pagtimbang-timbang sa kalihokan sa UMPylation sa HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediated protina.Paglumlum sa protina sa [α-32P] UTP sulod sa 10 ka minuto kung wala (A) o presensya (B) sa nsp12 sama sa gihulagway sa mga materyales ug pamaagi.Sa ibabaw sa A ug B, ang SDS-polyacrylamide gel nga namansahan sa Coomassie Brilliant Blue gipakita, ug sa ubos sa A ug B, ang katugbang nga autoradiograms gipakita.Ang posisyon sa protina molecular mass marker (sa kilodaltons) gihatag sa wala.Ang posisyon sa nsp12-His6 (B, ibabaw) ug ang radioactive signal nga naobserbahan sa panahon sa paglumlum sa nsp12-His6 uban sa nsp9-His6 (B, lane 7) gipakita usab, nga nagpakita nga ang [α-32P]UMP ngadto sa nsp9-His6 (12.9 kDa), nga wala maobserbahan alang sa ubang mga protina nga gisulayan.
HCoV-229E NiRAN-mediated biochemical ug virological nga kinaiya sa nsp9 NMPylation.(A ug B) Ang papel sa nucleotide co-substrate nga gigamit sa reaksyon.Ang Nsp12-His6 ug nsp9-His6 gisagol ug gilumlom sa presensya sa lain-laing [α-32P] NTPs sa standard NMPylation assay.(A, ibabaw) Coomassie-stained nsp9-His6 gibulag sa SDS-PAGE.(A, ubos) Autoradiograph sa parehas nga lugar sa gel.(B) Ang paryente nga kalihokan (mean ± SEM) sa presensya sa gitudlo nga nucleotide cofactor gitino gikan sa tulo ka independenteng mga eksperimento.*P≤0.05.(C) Ang papel sa metal ions.Gipakita ang sumbanan nga pagsulay sa NMPylation sa presensya sa [α-32P] UTP ug lainlaing mga ion nga metal, matag usa adunay konsentrasyon nga 1 mM.Sa C, sa ibabaw, ang Coomassie nga namansahan nga nsp9-His6 gipakita, ug sa C, sa ubos, ang katugbang nga autoradiography gipakita.Ang gidak-on sa gimarkahan nga protina (sa kilodaltons) gipakita sa wala sa A ug C. (D) Ang mutant nga porma sa HCoV-229E nsp12-His6 nga nagdala sa piho nga amino acid substitution anaa sa [α-32P]UTP, ingon sa gihulagway sa Mga Materyal ug Pamaagi.Ang radiolabeled nsp9-His6 nga gihimo sa NMPylation nga reaksyon nakita sa phosphorylation imaging (D, ibabaw).Ang relatibong kalihokan kon itandi sa wild-type (wt) nga protina gipakita sa D, ug ang ubos gikuha isip average (± SEM) gikan sa tulo ka Independent nga eksperimento.Ang mga asterisk nagpaila sa mga pagpuli sa dili gitipigan nga mga salin.(E) Ang titer sa virus sa supernatant sa kultura sa p1 nga mga selyula nakuha 24 ka oras human matino ang impeksyon pinaagi sa plaque assay.Ang mga pagpuli sa codon sa domain sa NiRAN sa gi-engineered nga HCoV-229E mutant gipakita (ang pag-numero sa nahabilin gibase sa ilang posisyon sa pp1ab).Ang kulang sa replikasyon nga RdRp aktibo nga site mutant nsp12_DD4823/4AA gigamit ingon usa ka kontrol.
Aron makakuha og mas lawom nga pagsabot sa aktibong site sa NiRAN ug mahibal-an ang mga residues nga may kalabutan sa kalihokan sa nsp9-specific nga NMP transferase, among gihimo ang mutation analysis, diin among gipulihan ang konserbatibong residues sa NiRAN AN, BN ug CN motifs ( 16) Kini mao ang Ala (SI appendix, Figure S2).Dugang pa, ang epekto sa konserbatibo nga Arg-to-Lys o Lys-to-Arg nga mga substitusyon gisusi sa duha ka mga kaso.Isip usa ka (negatibo) nga pagkontrol, ang mga salin nga dili o dili kaayo gikonserbar sa NiRAN domain sa mga coronavirus ug uban pang mga nested virus gipulihan sa Ala. Gipulihan ang K4116A (sa motif preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motif BN) ug D4280A (CN) kamahinungdanon pagkunhod o bisan pagwagtang sa nsp9 NMPylation pinaagi sa nsp12, samtang ang mga protina uban sa konserbatibo substitutions (R4178K), K4116R) nagpabilin 60% ug 80% sa ilang mga kalihokan, nga nagpakita nga ang pagpahayahay sa mga pagdili sa ilang tagsa-tagsa nga bahin. ang mga kadena sensitibo sa pisikokemikal (Figure 3D).Ang pag-ilis sa daghang uban pang gitipigan nga residues E4145A, D4273A, F4281A ug D4283A dili kaayo makadaot, ug ang nsp9 UMPylation gamay ra nga pagkunhod.Ang susamang mga resulta nakuha sa nsp9 NMPylation nga mga reaksyon nga naglambigit sa ubang mga NTP (Figure 3D ug SI appendix, Figure S3), nga nagpamatuod nga ang naobserbahan nga mga epekto sa piho nga mga substitution sa amino acid independente sa matang sa nucleotide co-substrate nga gigamit.Sunod, gisulayan namon ang posible nga epekto sa kini nga mga kapuli sa nsp12 sa pagkopya sa mga coronavirus sa kultura sa cell.Alang niini, migamit kamig angay nga genetically engineered complementary DNA (cDNA) templates nga gi-clone sa recombinant vaccinia virus (23, 24) aron ma-transcribe ang 5 -7 ka mga selula.Ang titration sa makatakod nga mga kaliwat sa virus nga gihimo niini nga mga selula nagpakita nga kadaghanan sa HCoV-229E NiRAN mutant dili mahimo (Figure 3E).Ang usa ka grupo sa mga non-viable viral mutants naglakip sa mga alternatibo nga gipakita sa pagwagtang o kamahinungdanon pagpakunhod sa transferase nga kalihokan sa vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), apan adunay duha ka laing mga alternatibo (K4116R, E4145A) 80 % gitagana?Ang ilang in vitro NMPylation nga kalihokan nagsugyot nga dugang nga mga pagdili ang nalangkit.Sa susama, duha pa ka mutasyon (R4178K, F4281A) nga hinungdan sa kasarangan nga pagkunhod sa kalihokan sa in vitro NMPylation sa NiRAN nga nagpatunghag buhi nga mga virus, bisan pa, kini nga mga virus labi nga nakunhuran ang mga titer pinaagi sa pagkopya.Nahiuyon sa datos sa kalihokan sa in vitro nga gipakita sa Figure 3D, gipulihan ang upat pa nga nahabilin nga wala gitipigan sa coronavirus ug/o uban pang mga nested virus (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) nagpatunghag buhi nga mga virus Ang mga anak, bisan pa adunay usa ka kasarangan nga pagkunhod sa titer kumpara sa wild-type nga virus (Figure 3E).
Aron matun-an kung ang NiRAN-mediated NMP transferase nga kalihokan nagdepende sa aktibo nga RdRp domain, ang duha ka gikonserbar nga Asp residues nga nalambigit sa koordinasyon sa divalent metal ions (11) sa RdRp motif C gipulihan sa Ala. Ang resulta nga protina nga nsp12_DD4823/4AA nagpabilin ang kalihokan sa nsp9 NMPylation, nga nagpakita nga ang nsp12-mediated in vitro nsp9 NMPylation nga kalihokan wala magkinahanglan og polymerase activity (SI Appendix, Figure S4).
Human maestablisar ang nsp9-specific nga NMP transferase nga kalihokan alang sa nsp12, gisulayan namo nga mailhan ang NMP-nsp9 adduct pinaagi sa mass spectrometry (MS).Ang kompleto nga protina mass spectrum sa recombinant HCoV-229E nsp9 nagpakita sa peak sa 12,045 Da (Figure 4A).Ang pagdugang sa nsp12 wala mag-usab sa kalidad sa nsp9, nga nagpakita nga ang nsp12 ug nsp9 dili mahimong usa ka lig-on nga komplikado ubos sa mga kondisyon nga gigamit (denaturasyon) (Figure 4A).Sa presensya sa UTP ug GTP, ang pagsukod sa masa sa reaksyon nga adunay nsp9 ug nsp12 matag usa nagpakita nga ang protina nga masa sa UTP mibalhin 306 Da, ug ang protina nga masa sa GTP mibalhin 345 Da, nga nagpakita nga ang matag molekula sa nsp9 nagbugkos sa usa ka UMP o GMP. (Hulagway 4) C ug D).Gibanabana nga ang enerhiya nga gikinahanglan alang sa NiRAN-mediated nsp9 NMPylation gikan sa NTP hydrolysis ug pyrophosphate release.Bisan tuod ang usa ka 10 ka pilo nga molar nga sobra sa nsp9 (target) kay sa nsp12 (enzyme) gigamit niini nga reaksyon, halos kompleto nga NMPylation sa nsp9 ang naobserbahan, nga nagpakita nga ang interaksyon tali sa nsp12 ug nsp9 dili magdugay, ug ang nsp12 mahimo nga NMPylate sa dugang nga nsp9 sa vitro molekula.
Single NMPylation sa nsp9 sa presensya sa nsp12 ug UTP o GTP.Gipakita ang deconvoluted complete protein mass spectrum sa HCoV-229E nsp9 (SI appendix, Table S1) (AD).(A) nsp9 lamang, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 sa atubangan sa UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 sa atubangan sa GTP.
Aron mahibal-an ang mga residu sa nsp9 nga UMPylated sa nsp12, ang nsp9-UMP gibuak sa trypsin.Ang resulta nga mga peptide gibulag sa nano-high performance liquid chromatography (HPLC) ug gisusi pinaagi sa tandem mass spectrometry (MS/MS) online.Ang pag-analisar sa datos gamit ang Byonic software package (Protein Metrics) nagpakita sa UMPylation sa N-terminal amino acid.Gikumpirma kini nga mano-mano.Ang tandem mass spectrum sa precursor peptide [UMP] NNEIMPGK (SI appendix, Figure S5A) nagpadayag sa usa ka tipik sa 421 m / z, nga nagpakita nga ang UMP nagbugkos sa nahabilin nga 1 sa nsp9.
Sa N-terminus sa nsp9, ang Asn gikonserbar sa mga miyembro sa Orthocoronavirinae (SI appendix, Figure S6).Bisan kung kami nagtuo nga ang N-terminal nga panguna nga amine nitrogen mao ang labing lagmit nga tigdawat alang sa UMP, nakahukom kami nga makakuha dugang nga ebidensya sa NMP nga nagbugkos sa N-terminal.Tungod niini nga hinungdan, ang non-NMPylated ug NMPylated N-terminal peptide nsp9 nga giputli sa HPLC nakuha sa presensya sa acetone ug sodium cyanoborohydride.Ubos niini nga mga kondisyon, ang libre nga panguna nga mga amina lamang ang mahimong usbon sa propyl (25).Ang N-terminal nga nsp9-derived peptide nga adunay han-ay nga NNEIMPGK adunay duha ka panguna nga amine, usa sa N-terminus sa Asn ug ang lain sa kilid nga kadena sa Lys sa C-terminus.Busa, ang mga grupo sa propyl mahimong ipaila sa duha ka tumoy.Ang gikuha nga ion chromatograms sa non-NMPylated peptides gipakita sa SI appendix, Figure S5B.Sama sa gipaabot, ang N-terminal ug C-terminal (mono)propylated (SI appendix, Figure S5B, upper lane) ug dipropylated peptides (SI appendix, Figure S5B, lower lane) mahimong mailhan.Kini nga sumbanan nagbag-o sa paggamit sa NMPylated N-terminal peptide sa nsp9.Sa kini nga kaso, ang C-terminal propylated peptides lamang ang mahimong mailhan, apan ang N-terminal propylated peptides ug dipropylated peptides wala mailhi (SI Appendix, Figure S5C), nga nagpakita nga ang UMP gibalhin sa N-terminal primary amine Aron mapugngan kini. grupo gikan sa paghimo sa mga pagbag-o.
Sunod, among ilisan (uban sa Ala o Ser) o tangtangon ang gitipigan nga mga nahabilin sa N-terminus sa nsp9 aron mahibal-an ang piho nga mga limitasyon sa target.Pinasukad sa among datos sa MS nga nagpakita nga ang NiRAN nagporma usa ka nsp9-NMP adduct nga adunay panguna nga amine sa nahabilin nga N-terminal sa nsp9, among gi-hypothesize nga ang nsp9 NMPylation nanginahanglan sa viral master protease (Mpro, nsp5) aron buhian ang nsp9 N-terminal gikan sa ang polyprotein precursor niini.Aron sulayan kini nga pangagpas, naghimo kami usa ka precursor protein nsp7-11 nga adunay nsp9 sa E. coli ug gihimo ang usa ka sumbanan nga pagsulay sa NMPylation sa presensya sa [α-32P] UTP (mga materyales ug pamaagi).Ingon sa gipakita sa Figure 5A (lane 3), ang uncut nsp7-11 precursor wala radiolabeled sa nsp12.Sa kasukwahi, kung ang nsp7-11 gibuak sa recombinant nsp5 aron buhian ang nsp9 (ug uban pang mga nsps) gikan sa nag-una, usa ka radiolabeled nga protina nga migrate nga adunay nsp9 ang nakit-an, nga nagpamatuod sa among konklusyon nga ang NiRAN ug N- Selective nga pagporma sa covalent nsp9-NMP adducts .Ang terminal nag-unang amine sa N-terminal Asn (posisyon 3825 sa pp1a/pp1ab).Kini nga konklusyon gisuportahan usab sa mga eksperimento gamit ang pagtukod sa nsp9, nga adunay usa o duha nga dugang nga nahabilin sa N-terminus.Sa duha ka mga kaso, ang NiRAN-mediated UMPylation sa nsp9 giwagtang (SI Appendix, Figure S7).Sunod, naghimo kami usa ka protina nga adunay usa o duha nga nahabilin nga Asn nga gitangtang gikan sa 3825-NNEIMPK-3832 peptide sequence sa N-terminal sa nsp9.Sa duha ka mga kaso, ang nsp9 UMPylation hingpit nga gibabagan (Figure 5B), nga naghatag dugang nga ebidensya nga ang tinuod nga nsp9 N-terminus naglihok isip usa ka NMP receptor.
Ang proteolytic nga pagproseso sa nsp9 ug ang papel sa N-terminal residues sa nsp12-mediated UMPylation.(A) nsp9 UMPylation nanginahanglan usa ka libre nga nsp9 N-terminal.Ang Nsp7-11-His6 pre-incubated sa 30 °C sa NMPylation detection buffer nga adunay UTP sa presensya o pagkawala sa recombinant Mpro (nsp5-His6).Human sa 3 ka oras, sugdi ang NMPylation assay pinaagi sa pagdugang sa nsp12-His6 sama sa gihulagway sa Materials and Methods.Ang reaksyon nga adunay nsp5-His6 (lane 1) ug nsp9-His6 (lane 2) gigamit isip kontrol.Human sa 10 minutos, ang reaksyon gihunong ug ang reaksyon nga timpla gibulag sa SDS-PAGE.Ang protina gimantsa sa Coomassie Brilliant Blue (A, ibabaw).Ang Nsp7-11-His6 precursor ug ang naproseso nga produkto nga resulta sa nsp5-His6 mediated cleavage gipakita sa tuo.Palihug timan-i (tungod sa ilang gamay nga gidak-on) nga ang nsp7 ug nsp11-His6 dili makit-an sa kini nga gel, ug ang reaksyon gidugangan sa nsp5-His6 (lanes 1 ug 4; ang posisyon sa nsp5-His6 gipakita sa usa ka solidong lingin) o nsp9-His6 (Lane 2) adunay gamay nga kantidad sa MBP (gipakita sa bukas nga mga lingin) isip nahabilin nga mga hugaw tungod kay kini gipahayag ingon nga MBP fusion nga mga protina (SI appendix, Table S1).(B) Ang Nsp9-His6 nga variant kulang sa usa o duha ka N-terminal Asn residues (residue numbering sumala sa posisyon sa pp1a/pp1ab) ug giputli ug gilumlom sa nsp12-His6 ug [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE nga namansahan sa Coomassie gipakita sa ibabaw, B, ang katugbang nga autoradiograph gipakita sa ubos.Ang posisyon sa molecular weight marker (sa kilodaltons) gipakita sa wala.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminal conserved residues gipulihan sa Ala o Ser, ug ang sama nga gidaghanon sa protina gigamit sa nsp12-His6 mediated UMPylation reaksyon.Ang mga produkto sa reaksyon gibulag sa SDS-PAGE ug gipintalan sa Coomassie Brilliant Blue (C, ibabaw), ug ang radiolabel nga nsp9-His6 nakit-an sa phosphorescence imaging (C, tunga).Gigamit ang wild-type (wt) nga protina isip usa ka reperensiya (gitakda sa 100%), ang paryente nga kalihokan sa NMPylation (mean ± SEM) gikalkulo gikan sa tulo ka independenteng mga eksperimento.(D) Ang mga titer sa virus sa p1 cell culture supernatant sa Huh-7 nga mga selyula nga nataptan sa HCoV-229E wild-type nga Huh-7 nga mga selula, ug ang mga mutant nga nagdala sa gitudlo nga amino acid substitutions sa nsp9 gitino pinaagi sa plaque assay.Ang kulang sa replikasyon nga RdRp motif C double mutant DD4823/4AA gigamit isip negatibo nga kontrol.
Ang N-terminus sa nsp9 (ilabi na ang mga posisyon 1, 2, 3, ug 6) gikonserbar kaayo sa mga miyembro sa Orthocoronavirinae subfamily (SI appendix, Figure S6).Aron matun-an ang posibleng papel niini nga mga residue sa nsp12-mediated nsp9 NMPylation, duha ka sunod-sunod nga Asn residues sa N-terminus sa nsp9 gipulihan sa Ala o Ser (nag-inusara o sa kombinasyon).Kung itandi sa wild-type nga nsp9, ang pag-ilis sa N3825 sa Ala o Ser miresulta sa labaw pa sa duha ka pilo nga pagkunhod sa nsp12-mediated UMPylation (Figure 5C).Nahiuyon sa among konklusyon nga ang NMPylation mahitabo sa N-terminal primary amine imbes sa kilid nga kadena sa N-terminal residue, among nakita ang mahinungdanong residual nga NMPylation uban sa pagpuli sa N3825A ug N3825S.Makaiikag, kung ang ikaduha nga Asn gipulihan sa Ala o Ser, ang nsp9 UMPylation makunhuran nga labi ka kusog (labaw sa 10 ka beses), samtang ang pagpuli sa Ala sa mga posisyon 3, 4, ug 6 adunay kasarangan nga epekto sa nsp9 UMPylation (Figure 2 .5C).Ang susamang mga resulta nakuha gamit ang ATP, CTP o GTP (SI appendix, Figure S8).Sa kinatibuk-an, kini nga mga datos nagpakita sa mahinungdanong papel sa N2826 (posisyon 2 sa nsp9) sa nsp9 NMPylation.
Aron makakuha og dugang nga ebidensya sa functional correlation tali sa N-terminus sa nsp9 ug NMPylation, naghimo kami og multiple sequence alignment (MSA) sa nsp9 sequence sa pamilyang Coronavirus (nagkalainlain tali sa 104 ug 113 residues) (SI Appendix, Figure. S6).Sa kinatibuk-an, sa 47 (nailhan ug putative) nga mga espisye sa 5 nga genera sa Orthocoronavirinae subfamily nga nag-infect sa lain-laing mga mammal, langgam, ug mga reptile host, 8 ra ang nahabilin sa kinatibuk-an ang nakit-an nga wala’y kalainan.Ang labing halapad nga mga pagbag-o, lakip ang mga pagtangtang ug pagsal-ot, nakita sa mga siklo tali sa mga elemento sa sekundaryong istruktura sa nsp9, ingon nga gitino sa miaging mga pagtuon sa istruktura (26 ??28).Lima ka invariant residues ang nakit-an sa β strand ug α helix sa C-terminal nga bahin sa nsp9.Tulo ka invariant residues naglangkob sa NNE motif sa N terminal sa nsp9.Gipadayag nga ang ikaduha nga Asn sa kini nga motibo mao ra ang nahabilin nga nahabilin, nga gipaambit usab sa hypothetical nsp9 sa layo nga may kalabutan nga baki coronavirus, ug nagrepresentar sa Microhyla letovirus 1 nga species sa subfamily Letovirinae sa Alphaletovirus.Ang pagkonserba sa mga nahabilin sa nsp9 nga mga elemento sa sekondaryang istruktura mahimong mapangatarungan pinaagi sa mga konsiderasyon sa istruktura aron mapadayon ang pagpilo o nahibal-an nga mga kabtangan sa pagbugkos sa RNA.Bisan pa, kini nga pangatarungan ingon og dili magamit sa pagkonserba sa NNE, ug sa wala pa kini nga pagtuon, ang kinaiya sa mga pagpugong nga naglimite sa pagkalainlain sa han-ay sa tripeptide hingpit nga natago.
Aron mahibal-an ang kahinungdanon sa nsp9-NMPylation ug konserbasyon sa NNE sa replikasyon sa coronavirus, naghimo kami mga mutant nga HCoV-229E, nga nagdala usa o doble nga pagpuli sa mga residu sa nsp9 N-terminal, nga nagpakita nga ang nsp9 NMPylation makadaot sa vitro.Sa wala pa kami magsugod, among gisulayan pagtubag ang pangutana kung kini nga mga substitusyon (duol sa nsp8 | 9 cleavage site) makaapekto sa pagproseso sa proteolytic sa rehiyon sa C-terminal pp1a.Usa ka set sa nsp7-11 polyprotein constructs nga adunay katugbang nga mga substitution sa N-terminus sa nsp9 gihimo sa E. coli ug giputol sa recombinant Mpro.Ang proteolytic cleavage sa upat ka mga site (lakip ang nsp9 flanking site) dili kaayo apektado sa bisan unsang gipaila nga mga substitutions (SI appendix, Figure S9), wala'y labot ang mga pagbag-o sa istruktura niini nga mga protina nga makabalda sa Mpro-mediated nsp8 | 9 cleavage (O uban pa) website.
Ang mga selyula sa Huh-7 gibalhin sa genome-length HCoV-229E RNA, pag-encode sa Ala o Ser nga mga substitusyon sa gitipigan nga NNE tripeptides (N3825, N3826, ug E3827) sa nsp9 N terminal, nga nagpakita nga kadaghanan sa mga mutasyon makamatay.Naluwas namo ang virus pinaagi sa pag-ilis sa Ser o Ala sa N-terminal Asn (N2835A o N2835S), apan napakyas sa pagbawi sa virus sa uban pang single ug double mutations sa NNE sequence (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Figure 5D).
Kini nga mga resulta nagpakita nga ang replikasyon sa mga coronavirus sa tissue culture gipugngan (parehas o susama), nga naglimite sa natural nga mutation sa nsp9 NMPylation nga mga site sa lawas, ug nagsuporta sa mahinungdanong papel niini nga tubag sa siklo sa kinabuhi sa mga coronavirus.
Sa katapusang hugpong sa mga eksperimento, naghimo kami og C-terminal His6 nga gimarkahan og SARS-CoV-2 nsp12 ug nsp9, ug duha ka mutant nga porma sa nsp12 sa E. coli.Ang aktibo nga mga residue sa site sa NiRAN ug RdRp nga mga dominyo kay gigamit ang Ala sa baylo (Figure 6A ug SI appendix, Table S2).Ang K4465 sa SARS-CoV-2 nsp12 katumbas sa K4135 sa HCoV-229E (SI Appendix, Figure S2), nga napamatud-an nga gikinahanglan alang sa kalihokan sa NiRAN ug HCoV-229E replication (Figure 3D ug E).Kini nga residue usab katumbas sa arterial virus EAV nsp9 K94 residue, nga kaniadto gipakita nga gikinahanglan alang sa NiRAN self-UMPylation / self-GMPylation (16).Sama sa gipakita sa Figure 6B, ang SARS-CoV-2 nsp12 adunay UMP transferase nga kalihokan gamit ang nsp9 isip substrate, samtang ang nsp12_K4465A active site mutant dili aktibo.Ang double substitution sa SDD nga kinaiya nga han-ay sa RdRp motif C dili makaapekto sa UMP transferase nga kalihokan (Figure 6B), nga nagpakita nga ang RdRp nga kalihokan walay direktang epekto sa nsp9 UMPylation.Ang susamang datos nakuha gamit ang CTP, GTP ug ATP (SI appendix, Figure S10).Sa katingbanan, kini nga mga datos nagpakita nga ang NiRAN-mediated nsp9 NMPylation adunay konserbatibo nga kalihokan sa mga coronavirus nga nagrepresentar sa lain-laing genera sa orthocoronavirus subfamily.
SARS-CoV-2 nsp12-gipatunga nga NMPylation sa nsp9.(A) Coomassie stained SDS-polyacrylamide gel nga nagpakita sa recombinant nga protina nga gigamit sa NMPylation test.Ingon usa ka kontrol, usa ka mutant nga protina nga adunay aktibo nga pagpuli sa site sa NiRAN domain (K4465A) ug RdRp domain (DD5152/3AA) sa SARS-CoV-2 nsp12 gigamit.Ang pag-numero sa residue gibase sa posisyon sa pp1ab.(B) Autoradiograph sa UMPylation detection gamit ang nsp9-His6 ug [α-32P]UTP isip substrate sa nsp12-His6 (wild type [wt] ug mutant).Ang molecular mass (sa kilodaltons) sa gimarkahan nga protina gipakita sa wala.
Ang mga dominyo sa NiRAN sa kasagaran gitipigan sa Nidovirales (16), nga nagpakita nga sila nag-catalyze sa mga reaksyon nga enzymatic nga kinahanglanon alang sa pagkopya sa Nidovirus.Niini nga pagtuon, napamatud-an namo nga ang NiRAN domain sa coronavirus nagbalhin sa NMP (namugna gikan sa NTP) ngadto sa nsp9, usa ka misteryosong RNA binding protein nga nalangkit sa pagkopya sa virus (26?? 29), aron matino kini isip natural nga target ug kauban sa coronavirus RTC.
Ang NiRAN domain nag-ambit sa tulo ka sunod-sunod nga mga motif (AN, BN, ug CN), nga adunay gamay kaayo nga gidaghanon sa mga nahabilin nga gitipigan sa tanan nga mga pamilya sa monophyletic apan lahi kaayo nga order sa Nidovirales (8, 16).Gipakita sa bag-ong mga pagtuon nga sila adunay kalabotan sa istruktura sa usa ka kadaghanan nga wala mailhi nga pamilya sa mga protina nga sama sa protina kinase, nga sa sinugdan gitawag nga pamilyang SelO (17, 19, 22, 30, 31).Ang mga protina nga may kalabotan sa SelO adunay kinase folds, apan kulang ang daghang gikonserbar nga mga residu sa aktibo nga site sa mga klasikal nga kinase (22, 32).Pinasukad sa reverse orientation sa mga molekula sa ATP nga gigapos sa aktibo nga site ug gipalig-on sa piho nga mga interaksyon, ang SelO gi-hypothesize ug pagkahuman gikumpirma nga ibalhin ang AMP (imbes nga phosphate) sa substrate sa protina (22), samtang ang lain nga bakterya nga SelO-sama sa protina nga YdiU adunay bag-o lang nga gipakita sa catalyze sa covalent attachment sa UMP sa Tyr ug sa Iyang mga residues sa lain-laing mga protina substrates (33).
Aron mapamatud-an ug mapalapad ang prediksyon sa putative active site residues sa coronavirus NiRAN domain, gigamit namo ang biochemical ug reverse genetics nga mga pamaagi sa paghimo sa mutation analysis sa coronavirus nsp12 (Figure 3D ug E ug SI appendix, Figure S3 ug table) S1â S4).Gipakita sa datos nga ang pag-ilis sa HCoV-229E K4135, R4178 ug D4280 nga adunay Ala nagwagtang sa kalihokan sa vitro NMP transferase ug pagkopya sa virus sa cell culture (Figure 3D ug E ug SI appendice, Figure S3), nga nagsuporta sa ilang presensya sa NTP γ-phosphate. (K4135, R4178) ug ang koordinasyon sa mga aktibong site nga metal ions (D4280).Ang E4145A nga pag-ilis sa gikonserbar nga Glu sa han-ay sa virus sa salag sa langgam nga gitagna nga mapalig-on ang K4135 (17) nga posisyon gipakita aron mawagtang ang pagkopya sa viral, apan katingad-an, ang kalihokan gipabilin sa in vitro NMPylation assay (Figure 3D ug E ug SI appendix, Figure S3 Ug Tables S1–S4).Ang usa ka susama nga obserbasyon gihimo sa dihang ang katugbang nga pagpuli gipaila sa YdiU homolog sa Salmonella typhimurium (E130A) (33).Sa tingub, kini nga mga datos nagsuporta sa regulatory function niining gitipigan nga nahabilin kaysa sa catalytic function.
Ang pag-ilis sa gikonserbar nga Phe residue (F4281A) sulod sa han-ay sa nestovirus sa HCoV-229E NiRAN domain (8) miresulta sa pagkunhod sa NMPylation nga kalihokan sa vitro ug usa ka mahinungdanon nga pagkunhod sa virus replication sa cell culture (Figure 3D, E ug SI) apendise, Figure S3).Ang datos nahiuyon sa importante nga regulatory function niini nga residue, sama sa homologous DFG motif Phe residue nga gipakita kaniadto.Sa classical protein kinases, kini kabahin sa Mg2+ binding loop ug makatabang sa pag-assemble ug pag-regulate sa spine???Gikinahanglan alang sa epektibo nga catalytic nga kalihokan (32, 34).Ang pag-ilis sa Ala ug Arg alang sa K4116 nga residues (sa preAN motif), matag usa, giwagtang ang viral replication ug, sama sa gipaabot, adunay lain-laing mga epekto sa NMP transferase nga kalihokan sa vitro, depende sa amino acid side chain nga gipaila (Figure 3D Ug E ug SI appendice , Hulagway S3).Ang datos sa pag-andar nahiuyon sa kasayuran sa istruktura, nga nagpakita nga kini nga nahabilin nagtukod usa ka interaksyon sa ATP phosphate (17).Sa NiRAN domain sa ubang mga nested virus nga mga pamilya, ang posisyon sa HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 giokupahan sa Lys, Arg o His (8), nga nagpakita nga ang functional restriction niining piho nga residue na-relax na.Ang pag-ilis sa D4188A ug D4283A nagwagtang o kusog nga nagpamenos sa kalihokan sa enzyme ug nagwagtang sa pagkopya sa virus (Figure 3).Kining duha ka residue gikonserbar sa kadaghanan (apan dili tanan) nga nagsalag nga mga virus (8), nga nagpakita sa usa ka importante nga espesipiko sa pamilya apan posible nga dili catalytic function.Ang mga pagpuli sa ala sa daghang ubang mga Lys ug Asp residues (K4113A, D4180A, D4197A ug D4273A) nga wala gitipigan sa Coronaviridae o ubang mga pamilya sa Nestioviridae (8) gigamit isip mga kontrol.Sama sa gipaabut, kini nga mga substitusyon labi ka maagwanta, nga adunay gamay nga pagkunhod sa kalihokan sa enzyme ug pagkopya sa viral sa pipila ka mga kaso (Figure 3 ug SI appendix, Figure S3).Sa kinatibuk-an, ang data sa coronavirus mutagenesis nahiuyon kaayo sa self-GMP ug reverse genetics data sa EAV NiRAN-RdRp (16), diin ang EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) residue K94 (katugbang sa HCoV- 229E K4135) importante nga mga gimbuhaton), R124 (katumbas sa R4178), D132 (katumbas sa D4188), D165 (katumbas sa D4280), F166 (katumbas sa F4281).Dugang pa, ang HCoV-229E mutagenesis data nahiuyon ug gipalapad gikan sa nauna nga gitaho nga SARS-CoV reverse genetics data (16), parehas kaayo sa naobserbahan alang sa katugbang nga CN motif nga Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 Ang phenotype nga gihulagway -F219A ug HCoV-229E_F4281A (Figure 3 D ug E ug SI appendix, Figure S3 ug Table S1-S4).
Kung itandi sa EAV orthologs (16), nga adunay klaro nga gusto sa UTP ug GTP (sa self-NMPylation reaction), gipakita sa among pagtuon nga ang coronavirus NiRAN domain (girepresentar sa HCoV-229E ug SARS-CoV-2) mahimong epektibo. gibalhin ang tanan nga upat ka mga NMP, bisan kung adunay gamay nga gusto alang sa UMP (Figures 1 ug 3).Ang medyo ubos nga espesipiko sa piho nga NTP co-substrate nahiuyon sa bag-o lang gitaho nga SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 supercomposite nga istruktura, diin ang ADP-Mg2+ nagbugkos sa aktibo nga site sa NiRAN, apan dili sa adenine Part. sa pagporma sa piho nga mga interaksyon (17).Sa among pagtuon, ang matang sa nucleotide nga gigamit sa NMPylation nga reaksyon walay differential effect sa kalihokan sa mutant protein (SI Appendix, Figure S3), nga nagpakita nga walay bisan usa niini nga mga residu ang suod nga may kalabutan sa pagbugkos sa usa ka piho nga nucleobase.Ang structural nga basehan ug potensyal nga biolohikal nga kahulogan sa lain-laing NTP co-substrate preferences naobserbahan sa NiRAN domains sa mga coronaviruses ug arterial virus nagpabilin nga tun-an;kini mahimong tinuod o mahimong tungod sa mga limitasyon sa ilang tagsa-tagsa nga mga pagtuon.Sa pagkakaron, dili mahimong isalikway nga ang potensyal nga kalihokan sa NMPylator sa arterial virus NiRAN domain (itandi sa kaniadto gihulagway nga kalihokan sa self-NMPylation) adunay lahi nga gusto sa co-substrate, nga gikonsiderar nga ang pagkaparehas tali sa arterial ug coronavirus. Ang NiRAN domain kay naa sa iyang limitasyon.Sequence-based Compare (16).Kon itandi sa pseudokinase SelO, nga naggamit sa Mg2+ isip cofactor, ang kalihokan sa coronavirus ug arterial virus NiRAN nagdepende sa Mn2+ (16) (Figure 3C ug SI appendix, Figure S1).Ang pagsalig sa Mn2+ ug dayag nga pagpalabi alang sa UTP usa ka talagsaon nga bahin sa mga NMPylator sa protina, ug bag-o lang napamatud-an sa YdiU nga protina sa Salmonella typhimurium, nga nag-catalyze sa estrikto nga Mn2+-depende sa protina nga chaperone UMPylation aron mapanalipdan ang mga selula gikan sa stress induction Cell ATP pool ( 33).
Ang bag-o nga gihulagway nga pagkaparehas sa istruktura tali sa coronavirus nga NiRAN domain ug cellular protein kinases (17, 19) naghatag dugang nga suporta alang sa katakus sa NiRAN nga covalently link sa NMP sa ubang mga protina nga among gitaho sa kini nga pagtuon.Gipunting namon ang among pagpangita alang sa posible nga mga target sa NiRAN sa mga protina nga gi-encode sa HCoV-229E ORF1a, nga nahibal-an nga direkta o dili direkta nga nagtabang sa RTC's ORF1b-encoded replicase (12, 35).Ang among mga eksperimento naghatag ug konklusyon nga ebidensya alang sa epektibo ug piho nga NMPylation sa nsp9 (Figure 2).Kung ang target nga protina gigamit sa sobra nga molar nga 8 hangtod 10 ka pilo nga mas taas kaysa sa enzyme (nsp12), gikumpirma nga ang nsp9 hingpit nga (mono)NMPized (Figure 4).Nakahinapos kami nga ang interaksyon tali sa nsp12 ug nsp9 mubo ra ug dili mahimong usa ka lig-on nga komplikado nga adunay nsp9 (kung wala ang ubang mga subunit sa RTC).Kini nga konklusyon gisuportahan sa mga pagtuon sa interaksyon sa protina sa SARS-CoV proteome (35).Giila sa pag-analisa sa MS ang nag-unang amine sa N-terminal residue sa nsp9 isip NMPylation site (SI appendix, Figure S5).Ang pagporma sa phosphoramidate bond ug ang N-terminal amino group nagpalahi sa NiRAN-mediated NMPylation activity gikan sa Pseudomonas syringae SelO-mediated AMPylation reaction, nga nag-catalyze sa pagporma sa O-linked AMP sa Ser, Thr, o Tyr residues Peptide adduct ( 22), ug ang S. typhimurium YdiU nagporma og O-linked (uban sa Tyr) ug N-linked (uban sa Iyang) peptide-UMP addducts.Ang limitado nga impormasyon nga anaa sa SelO nga pamilya sa mga protina nagpakita nga ang mga membro niining dako nga pamilya sa protina lahi kaayo sa pagporma sa peptide-NMP nga mga pagdugang.Kini usa ka makapaikag nga obserbasyon nga angayan sa dugang nga pagtuon.
Ang datos nga nakuha sa kini nga pagtuon nagdala kanamo sa hypothesize nga ang NMPylation sa nsp9 nanginahanglan usa ka libre nga N-terminus.Sa konteksto sa viral replication, kini igahatag sa proteolytic cleavage sa nsp8|nsp9 processing site sa replicase polyprotein pp1a nga gihusay ni Mpro ug pp1ab.Sa kadaghanan sa mga coronavirus, ang kalainan tali sa kini nga piho nga site (VKLQ|NNEI sa HCoV-229E) ug ang tanan nga ubang mga site sa cleavage sa coronavirus Mpro mao ang Asn (kaysa sa usa ka gamay nga nahabilin, sama sa Ala, Ser Or Gly) nag-okupar sa P1â???Lokasyon (36).Ang peptide cleavage data nga nakuha sa unang mga pagtuon nagpakita nga ang cleavage efficiency sa nsp8|nsp9 site mas ubos kay sa ubang mga site, nga nagpakita nga 1) kini nga piho nga site mahimong adunay usa ka regulatory nga papel sa tukma sa panahon nga koordinado nga pagproseso sa C-terminal. pp1a rehiyon, o 2) a Ang papel sa espesyal nga gitipigan nsp9 N-terminus sa virus replication (37).Ang among datos (Figure 5A) nagpakita nga ang recombinant nga porma sa nsp9 nga nagdala sa tinuod nga N-terminal sequence epektibo nga NMPized sa nsp12.Ang N-terminal flanking sequence gikuha pinaagi sa factor Xa (nsp9-His6; SI appendix, Table S1) o Mpro-mediated cleavage (nsp7-11-His6; Figure 5A ug SI appendix, Table S1).Importante, ang uncut nsp9-containing precursor nsp7-11-His6 nagpakita sa pagsukol sa NMPylation sa nsp12, nga nahiuyon sa among datos, nga nagpakita nga ang nsp9-NMP adduct naporma pinaagi sa N-terminal primary amine (SI appendix, Figure S5) .Aron makaangkon og mas lawom nga pagsabot sa espesipiko sa substrate sa NiRAN, nagpunting kami sa kasikbit nga N-terminal residues sa nsp9.Kung wala ang uban nga mga protina, sila structurally flexible, nga nagpugong kanila nga makit-an sa wala'y label nga porma sa nsp9 (26 28, 38), nga nagpakita sa ilang limitado nga natural nga kausaban Kini tungod sa importante nga sequence-specific (dili secondary structure related) function sa nsp9 N-terminal fragment.Ang mga substitusyon sa ala sa gitipigan nga mga residu sa niini nga rehiyon (Figures 5C ug D ug SI appendix, Figure S8) nagpadayag nga ang N3826 kinahanglanon alang sa nsp9 NMPylation sa vitro, samtang ang N3825A ug E3827A nga mga substitusyon mosangpot sa pagkunhod sa M3829A ug P3830A nga mga substitusyon. .Dayag nga makaapekto sa nsp9 NMPylation.Bisan tuod ang pag-ilis sa N-terminal Asn (N3825A, N3825S) adunay kasarangan lamang nga epekto sa nsp9 NMPylation ug pagkopya sa virus sa cell culture (Figure 5C ug D), ang pagtangtang sa usa ka Asn residue sequence gikan sa N-terminal 3825-NN dipeptide Napamatud-an nga Makapatay kini sa mga virus, nga nagpakita nga gikinahanglan ang usa ka residue sa Asn sa dili pa ang laing nahabilin sa N-terminus, mas maayo ang Asn, bisan pa nga morag ang pagpuli sa susama nga mga residu mahimong partially tolerated (Figure 5B, C, ug D).Gitapos namon nga ang 3825-NN dipeptide, labi na ang gitipigan ug hinungdanon nga nahabilin nga N3826 sa sulud sa coronavirus (SI appendix, Figure S6), nagsiguro sa husto nga pagbugkos ug oryentasyon sa nsp9 N-terminus sa aktibo nga site sa NiRAN.
Ang pag-ilis sa Ala (E3827A) alang sa gitipigan nga Glu sa tanan nga mga subfamilies nagpabilin ang nsp9 NMPylation sa vitro apan makamatay sa mga virus sa cell culture (Figure 5C ug D), nga nagpakita sa dugang nga function niini nga nahabilin, pananglitan, sa mga importanteng interaksyon (NMPylated o wala giusab. ) nsp9 N-terminus ug uban pang mga hinungdan nga nalangkit sa pagkopya sa virus.Ang mga mutasyon sa Nsp9 wala makaapekto sa proseso sa proteolytic sa nsp9 o bisan unsang kasikbit nga nsps (39) (SI Appendix, Figure S9), nga nagpakita nga ang mga lethal phenotypes sa daghang mga nsp9 mutations nga naobserbahan dili tungod sa dysregulation sa C proteolytic process-terminal pp1a area. .
Ang datos sa ibabaw naghatag og ebidensya nga human sa Mpro-mediated nga pagtambal sa nsp8|9 cleavage site sa pp1a/pp1ab, ang N-terminus sa nsp9 mahimong UMPylated (o partially modified sa laing NMP).Dugang pa, ang maayo kaayo nga pagkonserba sa N-terminus sa nsp9 (lakip ang singular ug invariant Asn residues sa coronavirus family) ug ang reverse genetics data nga nakuha niini nga pagtuon (Figures 3E ug 5D) mitultol kanato sa paghinapos nga ang gihulagway nga nsp9 NMPylation kay biologically related ug importante para sa coronavirus replication.Ang mga sangputanan sa kini nga pagbag-o nagpabilin nga tun-an, pananglitan, bahin sa nauna nga gihulagway (dili piho) nsp9 (wala mabag-o nga porma) nga kalihokan sa pagbugkos sa RNA (2628).N-terminal NMPylation mahimo usab nga makaapekto sa interaksyon sa nsp9 uban sa protina o RNA substrates o sa pagporma sa lain-laing mga upat ka lebel nga mga asembliya.Naobserbahan kini sa mga pagtuon sa istruktura ug nakumpirma nga adunay kalabotan sa pagkopya sa coronavirus, bisan kung labi na kung wala ang Sa kaso sa kini nga pagbag-o (26- ââ29, 40).
Bisan kung ang target nga espesipiko sa coronavirus NiRAN domain kinahanglan pa nga mahibal-an sa labi ka detalye, gipakita sa among datos nga ang piho nga target sa protina sa domain sa coronavirus NiRAN hiktin kaayo.Bisan kung ang pagkonserba sa mga yawe nga aktibo nga residu sa site (8, 16) sa domain sa NiRAN sa tanan nga mga pamilya sa nidovirus kusganong nagsuporta sa kalihokan sa gikonserbar nga NMPylator niini nga mga protina, ang identidad sa substrate nga nagbugkos nga pocket residues niini nga domain Ang Conservation ug conservation nagpabilin nga gihulagway. , ug mahimong magkalahi tali sa lain-laing mga pamilya sa mga katuyoan sa Nidovirales.Sa susama, ang mga may kalabotan nga target sa ubang mga nested virus wala pa matino.Mahimo kini nga mga hilit nga ortholog sa nsp9 o uban pang mga protina, tungod kay ang mga han-ay sa gawas sa lima ka mga replicase nga domain nga kasagarang gitipigan sa mga nested virus dili kaayo gitipigan (8), lakip ang genome array tali sa Mpro ug NiRAN, Lakip kanila, ang nsp9 nahimutang sa corona nga bayrus.
Dugang pa, dili nato karon isalikway ang posibilidad nga ang NiRAN domain adunay dugang (lakip ang cellular) nga mga target.Sa kini nga kaso, angay nga hisgutan nga ang mga bacterial homologue sa kini nga emerging protein NMPylators (NMPylators) (30, 31) daw adunay "master regulators"?Ang NMP nag-modulate sa nagkalain-laing cellular proteins aron ma-regulate o mawagtang ang ilang downstream nga mga kalihokan, sa ingon adunay papel sa lain-laing mga biological nga proseso, sama sa cellular stress response ug redox homeostasis (22, 33).
Sa kini nga pagtuon (Mga Figure 2 ug 4 ug SI Appendix, Mga Figure S3 ug S5), napamatud-an namon nga gibalhin sa nsp12 ang bahin sa UMP (NMP) sa usa ka posisyon (gitipigan) sa nsp9, samtang ang ubang mga protina wala gibag-o sa gigamit Ubos sa mga kondisyon, gisuportahan pag-ayo (imbes nga luag) nga espesipiko sa substrate.Nahiuyon niini, kung itandi sa N-terminal nsp9 NMPylation, ang kaugalingon nga kalihokan sa NMPylation sa nsp12 gamay ra kaayo, ang pagtuki niini nanginahanglan mas taas nga oras sa pagkaladlad sa autoradiography, ug gigamit ang 10 ka pilo nga pagtaas sa konsentrasyon sa nsp12.Dugang pa, ang among MS analysis napakyas sa paghatag og ebidensya alang sa NMPylation sa nsp12, nga nagsugyot nga ang NiRAN domain self-NMPylation mao ang (labing maayo) usa ka ikaduha nga kalihokan.Bisan pa, kinahanglan nga matikdan nga ang ubang mga pagtuon naghatag pasiuna nga ebidensya nga ang kahimtang sa self-AMPylation sa bacterial NMPylator mahimong makontrol ang ilang kalihokan sa NMPylation sa ubang mga substrate sa protina (22, 33).Busa, gikinahanglan ang dugang nga panukiduki aron masusi ang posible nga mga epekto sa pagpaandar sa kaugalingon nga mga kalihokan sa NMPylation nga gitaho alang sa EAV nsp9 (16) ug coronavirus nsp12 (kini nga pagtuon), lakip ang gisugyot nga chaperone-like effect sa pagpilo sa C-terminal RdRp domain ( 16) ).
Kaniadto, daghang mga hypotheses bahin sa posible nga downstream function sa nidoviral NiRAN domain ang gikonsiderar, lakip ang RNA ligase, RNA-capped guanylate transferase ug kalihokan sa pag-priming sa protina (16), apan wala’y usa niini nga nahiuyon sa magamit nga mga gimbuhaton sa ubos.Ang impormasyon nga nakuha sa mga musunod nga posisyon parehas ra nga oras nga wala maghimo dugang nga mga pangagpas.Ang datos nga nakuha sa kini nga pagtuon labi ka nahiuyon sa (apan dili mapamatud-an) nga ang domain sa NiRAN nalangkit sa pagsugod sa synthesis sa RNA nga gipahinabo sa protina.Gituohan kaniadto nga ang function sa NiRAN domain sa 5??Ang ²-RNA capping o RNA ligation nga mga reaksyon dili apektado niini ug Suporta sa ubang mga datos.Busa, pananglitan, ang aktibong dapit sa NiRAN gikonsiderar nga naglakip sa gikonserbar nga Asp isip usa ka kinatibuk-ang base (D252 sa Pseudomonas syringae SelO; D4271 sa HCoV-229E pp1ab; D208 sa SARS-CoV-2 nsp12) (SI Appendix, numero 2 ).S2) (17, 22, 33), samtang ang catalysis sa ATP-dependent RNA ligase ug RNA capping enzyme gihimo sa covalent enzyme-(lysyl-N) -NMP intermediate, nga naglakip sa non- Changed Lys residue ( 41).Dugang pa, ang talagsaon nga pagkasunod-sunod nga gibase sa espesipiko sa coronavirus NiRAN alang sa gitipigan nga mga target sa protina ug ang relaks nga espesipiko alang sa NTP co-substrates (mas gusto sa UTP) supak sa NiRAN-mediated capping enzyme o RNA ligase-like functions.
Dayag, daghang dugang nga trabaho ang gikinahanglan aron mapamatud-an ug, kung mapamatud-an, ipasabut ang posible nga papel sa nsp9-UMP (nsp9-NMP) sa synthesis sa RNA nga gipahinabo sa protina, nga magkonektar sa daghang makapaikag apan (sa pagkakaron) mga taho nga gitaho kaniadto. .Nalain nga mga obserbasyon.Pananglitan, nahibal-an nga ang katapusan sa negatibo nga strand RNA sa coronavirus magsugod sa usa ka oligo(U) strand (42, 43).Kini nga obserbasyon nahiuyon sa ideya nga ang synthesis sa negatibo nga strand RNA gisugdan pinaagi sa pagbugkos sa UMPylated nga porma sa nsp9 sa poly (A) nga ikog ( mga trigger), nga mahimo’g mapauswag pinaagi sa pagbugkos sa RNA niini Ang kalihokan ug / o pakig-uban sa laing RTC nga protina.Ang bahin sa UMP nga gihatag sa nsp9 mahimong magamit ingon usa ka "primer" alang sa nsp7/8/nsp12-mediated oligouridylation, gamit ang 3??²-poly(A) nga ikog sa genomic RNA o Lain nga oligo (A) nga adunay pagkasunod-sunod nagsilbi nga template, susama sa mekanismo nga gitukod alang sa picornavirus VPg protein (44).Unsa kaha kon ang proposal kay “non-normative”????Ang pagsugod sa (protina-induced) negatibo nga strand RNA synthesis naghatag usa ka link sa mga obserbasyon, nga nagpakita nga ang coronavirus negatibo nga strand RNA adunay UMP (imbes nga UTP) sa katapusan niini (42), nga giisip nga nagpaila nga ang Ang nucleic acid nga Dicer nagputol sa tumoy sa phosphorylated sa usa ka wala mailhi nga uridine-specific endonuclease.Kung mapamatud-an, kini nga nucleic acid hydrolytic nga kalihokan makatabang sa pagpagawas sa oligomeric UMPylated nga porma sa nsp9 gikan sa 5 ² nga tumoy sa nascent negatibo nga strand.Ang posible nga papel sa nsp9 sa pag-priming sa protina nahiuyon usab sa nangaging reverse genetics nga mga pagtuon, nga nagpakita nga ang nsp9 (ug nsp8) nakig-interact sa kritikal ug espesipiko sa gitipigan nga cis-acting RNA nga elemento duol sa 3 nga tumoy sa coronavirus genome.45).Sumala sa kini nga taho, kini nga mga nauna nga obserbasyon mahimo nang susihon pag-usab ug mapalapdan pinaagi sa dugang nga panukiduki.
Sa katingbanan, gitino sa among datos ang espesipikong kalihokan sa usa ka proprietary nested virus enzyme tag nga nalambigit sa RdRp sa N-terminus.Sa coronavirus, kining bag-ong nadiskobrehan nga NiRAN-mediated UMPylator/NMPylator nga kalihokan gigamit sa pagsalig sa Mn2+ ug kasikbit nga Asn residues ug hinungdan sa pagkaporma sa (ubos-enerhiya) phosphoramidate bonds sa N-terminal primary amine.Pinaagi sa Mpro-mediated cleavage sa nsp8|9 cleavage site, ang target sa nsp9 mahimong magamit alang sa NMPylation, nga nagpakita sa functional coupling tali sa protease ug sa NiRAN domain, nga moabot sa RdRp.Ang pagkonserba sa yawe nga residues sa nsp12 NiRAN active site ug ang nsp9 target, inubanan sa datos nga nakuha gikan sa duha ka coronaviruses lakip na ang SARS-CoV-2, naghatag ug lig-on nga ebidensiya nga ang nsp9 NMPylation usa ka coronavirus Konserbatibo nga mga feature kay importanteng lakang sa virus replication.Ang magamit nga datos nagdala kanamo sa paghinapos nga ang piho nga papel sa NMPylated nga porma sa nsp9 sa protina-induced RNA synthesis usa ka makatarunganon nga senaryo alang sa coronavirus ug uban pang mga nested virus, ug ang NiRAN mahimo usab nga target ang uban pang wala mailhi nga mga protina.I-regulate ang virus.Interaksyon sa host.Kung mapamatud-an, ang pagkalambigit sa mga primer sa protina sa viral RNA synthesis makadugang sa pagkasunod-sunod nga pagkadugtong sa Mpro/3CLpro ug RdRp nga mga dominyo tali sa namatikdan kaniadto nga coronavirus ug sama sa picornavirus nga supergroup (9), nga karon nahiusa na sa bag-ong natukod nga Pisonivirites ( 46) sa kategorya.
Gipakita usab sa among datos nga ang sukaranan, pinili ug konserbatibo nga kalihokan sa enzyme nga nahibal-an sa kini nga pagtuon mahimong magamit ingon mga target sa mga tambal nga antiviral.Ang mga compound nga makabalda sa pagbugkos (ug sunod-sunod nga pagbag-o) sa gitipigan nga nsp9 N-terminus sa aktibo nga site sa NiRAN mahimong maugmad nga epektibo ug daghang gamit nga antiviral nga tambal, nga angay alang sa pagtambal sa mga coronavirus sa hayop ug tawo gikan sa lainlaing (sub) nga mga impeksyon sa genus. , lakip ang SARS-CoV-2 ug Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus.
Ang coding sequence sa coronavirus protein nga gihimo niini nga pagtuon gipadako sa RT-PCR gamit ang RNA nga nahimulag sa Huh-7 nga nataptan sa HCoV-229E o Vero E6 nga nataptan sa SARS-CoV-2, ug gisulod gamit ang standard cloning procedures.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) o pASK3-Ub-CHis6 (47) expression vector (SI Appendix, Tables S1 ug S2).Ang mga solong kapuli nga codon gipaila sa PCR-based nga site-directed mutagenesis (48).Aron makahimo sa MBP fusion protein, ang E. coli TB1 nga mga selula giusab uban ang angay nga pMAL-c2 plasmid construct (SI appendix, Table S1).Ang fusion protein giputli pinaagi sa amylose affinity chromatography ug gipikas sa factor Xa.Pagkahuman, ang C-terminal nga His6-tag nga protina giputli sa Ni-immobilized metal affinity chromatography (Ni-IMAC) sama sa gihulagway kaniadto (49).Aron makahimo sa ubiquitin fusion protein, ang E. coli TB1 nga mga selula naggamit sa tukma nga pASK3-Ub-CHis6 plasmid construct (SI Appendix, Tables S1 ug S2) ug pCGI plasmid DNA nga nag-encode sa ubiquitin-specific C-terminal hydrolase 1 (Ubp1).Pagbag-o (47).Ang C-terminal nga His6-tag nga coronavirus nga protina giputli sama sa gihulagway kaniadto (50).
Ang self-NMPylation test sa HCoV-229E nsp12-His6 gihimo sama sa gihulagway sa EAV nsp9 (16).Sa laktod, ang nsp12-His6 (0.5 µM) adunay 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM buffer ang espesipikong NTP ug 0.17 µM mitakdo sa [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) sa 30 °C sulod sa 30 minutos.Sa tanan nga uban pang (standard) nga mga pagsulay sa NMPylation sa nsp12-mediated nsp9 NMPylation, ang mga kondisyon sa reaksyon gi-adjust sama sa mosunod: nsp12-His6 (0.05 µM) ug nsp9-His6 (4 µM) sa presensya sa 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0 ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM nagpakita nga NTP, ug 0.17 µM nga gipares sa [α32-P]NTP.Human sa paglumlum sulod sa 10 minutos sa 30 ° C, ang sample nga reaksyon gisagol sa SDS-PAGE sample buffer: 62.5 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% glycerol ug 0.005% bromophenol asul.Ang protina gi-denatured pinaagi sa pagpainit sa 90 °C sulod sa 5 minutos ug gibulag sa 12% SDS-PAGE.Ang gel giayo ug gimantsa sa Coomassie Brilliant Blue nga solusyon (40% methanol, 10% acetic acid, 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250), dekolor, ug naladlad sa usa ka phosphorescent imaging screen sulod sa 20 ka oras (aron makit-an ang nsp12 gikan sa NMPylation) o (maximum) 2 Oras (aron masusi ang nsp9 NMPylation).Usa ka Typhoon 9200 imager (GE Healthcare) ang gigamit sa pag-scan sa screen ug ang ImageJ gigamit sa pag-analisar sa signal intensity.
Para sa MS analysis, 1 µM nsp12-His6 ug 10 µM nsp9 (walay hexahistidine tag) gigamit sa NMPylation analysis (SI appendix, Table S1) ug ang dugang nga konsentrasyon sa 500 µM UTP ug GTP gigamit.Depende sa ilang konsentrasyon ug gipaabot nga kalidad sa protina, ang Waters ACQUITY H-Class HPLC nga sistema nga gisangkapan og MassPrep column (Waters) gigamit sa pag-desalt sa 1 ngadto sa 10 µL sa buffered protein solutions online.Ang desalted nga protina gi-eluted ngadto sa electrospray ion nga tinubdan sa Synapt G2Si mass spectrometer (Waters) pinaagi sa mosunod nga gradient sa buffer A (tubig/0.05% formic acid) ug buffer B (acetonitrile/0.045% formic acid), ug ang column temperature mao ang 60 ° C ug usa ka flow rate nga 0.1 mL/min: elution isocratically nga adunay 5% A sulod sa 2 ka minuto, dayon usa ka linear gradient ngadto sa 95% B sulod sa 8 minutos, ug ipadayon ang 95% B sa laing 4 ka minuto.
Positibo nga mga ion nga adunay mass range nga 500 ngadto sa 5000 m/z ang nakita.Ang Glu-fibrinopeptide B gisukod matag 45 segundos alang sa awtomatik nga mass drift correction.Gamita ang MassLynx instrument software nga adunay MaxEnt1 extension aron ma-deconvolve ang average spectrum human ma-deduct ang baseline ug smoothing.
Ang UMPylated HCoV-229E nsp9 natunaw pinaagi sa pagdugang sa sequencing-grade modified trypsin (Serva) ug gilumlom sa tibuok gabii sa 37 °C.Usa ka Chromabond C18WP spin column (bahin nga numero 730522; Macherey-Nagel) gigamit sa pag-desal ug pagkonsentrar sa mga peptide.Sa katapusan, ang peptide natunaw sa 25 µL nga tubig, nga adunay 5% acetonitrile ug 0.1% formic acid.
Ang mga sampol gisusi sa MS gamit ang Orbitrap Velos Pro mass spectrometer (Thermo Scientific).Ang kinatas-ang nanoâ HPLC nga sistema (Dionex), nasangkapan sa usa ka naandan nga end-mounted 50 cm??75 μm C18 RP column nga puno sa 2.4 μm magnetic beads (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Sumpaysumpaya ang mass spectrometer online pinaagi sa Proxeon nanospray source;i-inject ang 6 µL nga trypsin digestion solution ngadto sa 300 µm inner diameter ×??1 cm C18 PepMap pre-concentration column (Thermo Scientific).Gamit ang tubig/0.05% nga formic acid isip solvent, ang sample awtomatikong natanggong ug na-desalinate sa flow rate nga 6 µL/min.
Ang mosunod nga mga gradients sa tubig/0.05% formic acid (solvent A) ug 80% acetonitrile/0.045% formic acid (solvent B) gigamit aron makab-ot ang pagbulag sa tryptic peptides sa flow rate nga 300 nL/min: 4% B para sa 5 minutos, dayon 30 A linear gradient ngadto sa 45% B sulod sa mga minuto, ug usa ka linear nga pagtaas ngadto sa 95% solvent B sulod sa 5 minutos.Ikonektar ang chromatographic column sa usa ka stainless steel nano-emitter (Proxeon), ug i-spray ang eluent direkta sa gipainit nga capillary sa mass spectrometer gamit ang potensyal nga 2,300 V. Ang survey scan nga adunay resolusyon nga 60,000 sa Orbitrap mass analyzer nalangkit. nga adunay labing menos tulo ka mga datos nga MS / MS scan, dinamikong wala iapil sa 30 segundos, gamit ang linear ion trap collision induced dissociation o mas taas nga energy collision dissociation inubanan sa orbitrap detection , Ang resolusyon mao ang 7,500.
Oras sa pag-post: Aug-03-2021